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15岁时参加上海电视台的综艺舞蹈队，正式自食其力自己赚取学费。1993年，被选中主演电影《刘海粟》，那是她第一次饰演电影角色，收获800元片酬。1994年，考入上海戏剧学院94级表演系本科。1996年，在电视剧《真空爱情记录》中饰演夏文心，讲述了一群大学毕业生为了工作和爱情奋斗的故事。
1998年，毕业于上海戏剧学院，毕业后参演了第一部改编自陕西驻沪作家李春平同名小说的电影《玻璃是透明的》，马伊琍饰演“小丫子”，同年出演的第一部古装电影《孔乙己》至今没有公映。
2000年，出演了《黑洞》饰演三陪女，马伊琍的表演事业得到了更好的提升，在电视剧《前世今生》中饰演美貌且气质超凡的秦婉莹。2001年，出演电视剧《白天睡觉的女人》饰演李秀，在电影《西施眼》中饰演施雨，该剧在2002年美国夏威夷国际电影节中获评审团大将及亚洲最佳电影。2002年，因出演电视剧《还珠格格Ⅲ之天上人间》中夏紫薇一角而被大众所熟知。
2004年，出演了由黄磊指导的《天一生水》饰演一个混血姑娘明妮。2005年，出演张黎导演的电视剧《锦衣卫》在剧中就出演了一个这样的倾国美人客印月。2006年，参演《乔家大院》扮演的“江雪瑛”。2007年，出演由赵宝刚指导的青春励志电视剧《奋斗》夏琳一角而知名度得到进一步的提升。
2008年，因拍电视剧《为谁心动》时无悔剃光了头，凭借影片《江北好人》，马伊琍战胜了李冰冰、范冰冰两位大热候选人，成为了长春电影节影后。2009年，与佟大为共同出演了电视剧《婚姻保卫战》演出夫妻间事。同年马伊琍出演了首部反映豫商故事的电视剧《经纬天地》在CCTV-8播出，这也是她继《乔家大院》之后首次登陆央视，马伊琍扮演尚达志的妻子顺儿，这也是马伊琍生产复出首部电视剧作品。
2010年，与涂松岩领衔主演的都市题材电视剧《双城生活》反映了“双城恋”话题，让许多观众产生了不小共鸣并引发了网络热议，而马伊琍在剧中饰演北京大妞郝京妮。凭借该剧获得国剧盛典2011年度最佳女演员。2013年，年初马伊琍与杜淳、刘莉莉、陈思斯等众多明星合作电视剧《青春期撞上更年期Ⅱ》，此外，还客串电影《不二神探》，并且彻底颠覆以往的形象。2013年，首当制片人的马伊琍与首次当导演的丈夫文章合作的电视剧《小爸爸》。
2015年，出演了公路犯罪片《未择之路》。电视剧《北上广不相信眼泪》于11月7日在北京卫视、浙江卫视播出；7月16日，参演的民国时期战争题材作品《那些女人》正式杀青。2016年1月，与陈建斌领衔主演的当代都市幽默轻喜剧《中国式关系》于在北京杀青。4月，在文章执导的谍战剧《剃刀边缘》中饰演女主角。2017年，主演都市情感剧《我的前半生》，在剧中饰演罗子君，凭借该剧获得第24届上海电视节“白玉兰奖”最佳女主角。
2018年，凭借电影《那些女人》获得第21届上海国际电影节电影频道传媒关注单元最佳女配角奖；9月14日，其主演的犯罪电影《未择之路》上映，片中饰演一名卡车司机小眉；9月30日，与姚晨共同主演的剧情片《找到你》上映。
2019年4月6日，与高伟光主演的民国探案剧《爱思小姐探案集》在横店开机，在剧中饰演了法租界警务局中央巡捕房探员苏雯丽；4月26日，凭借电影《找到你》获得第10届中国电影导演协会年度女演员奖；6月12日，凭借电影《找到你》获得第25届华鼎奖中国电影最佳女主角；6月，将担任第25届上海电视节白玉兰奖电视剧类别中国电视剧单元评委；9月22日，与刘烨合作主演的都市创业剧《在远方》播出；10月22日，凭借电影《找到你》提名第32届中国电影金鸡奖最佳女主角；11月，主演由薛晓路执导的职场现实题材剧《在不安的世界安静地活》，在剧中饰演林墨。
